Le jeu se déroule sur le complexe tropical de l'île Delfino, qui a la forme d'un dauphin et comprend dix emplacements principaux. L'île est habitée principalement par les courses Piantas et Nokis. Delfino Plaza est la capitale de l'île Delfino et le moyeu principal du jeu. Mario part pour l'île Delfino pour des vacances avec la princesse Peach, son intendant de longue date Toadsworth, et quelques autres crapauds, en espérant pour des vacances reposantes. À l'arrivée, ils constatent que l'île une fois vierge a été pollué et plâtré avec des graffitis. À la suite de cette pollution, objets en forme de soleil-disant «lutins Shine", les sources d'énergie de l'île, ont disparu, et l'île est couverte dans une ombre perpétuelle. Le coupable vu répandre le graffiti est déguisé en Mario (dénommée "Shadow Mario"). Mario est rapidement arrêté comme il arrive, faussement accusé de vandaliser l'île. Il est mis à l'essai, reconnu coupable et condamné à nettoyer les graffitis et de récupérer les lutins Shine. Pour aider avec le nettoyage, Mario trouve FLUDD, un canon à eau puissant qui est toted comme un sac à dos. Mario se lance dans une aventure pour effacer son nom et de localiser le vrai criminel, tout en rétablissant la tranquillité et l'ordre à l'île Delfino.
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